BMP4 and Gremlin 1 regulate hepatic cell senescence during clinical progression of NAFLD/NASH.

Riassunto

Il ruolo della senescenza nelle cellule del fegato nella NAFLD e nella NASH non è del tutto compreso. Allo scopo di studiarla, abbiamo realizzato delle biopsie epatiche in 58 pazienti con e senza NAFLD/NASH estensivamente caratterizzati da un punto di vista clinico. I risultati ottenuti dimostrato che la senescenza delle cellule epatiche è fortemente correlata al grado di severità di NAFLD/NASH. Inoltre una analisi informatica sofisticata di tutti i parametri a disposizione (machine learning) ha permesso di identificare i marcatori di senescenza, l’espressione di Gremlin 1 (inibitore di BMP4) nel fegato e nel grasso viscerale e la quantità di tessuto adiposo viscerale come potenti predittori. Esperimenti in vitro su sferoidi (colture cellulari 3D) ottenuti da cellule stellate ed epatociti umani dimostrano l’attività di BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4) come proteina anti-senescenza, anti-steatosi, anti-infiammatoria e anti-fibrotica e al contrario l’attività di Gremlin 1 (proteina altamente espressa nel tessuto adiposo viscerale umano) come pro-senescenza e come antagonista di BMP4. Le proteine che agiscono a favore e contro la senescenza cellulare agiscono sulla via di segnale governata dai fattori YAP/TAZ, che diventa pertannto una via chiave di regolazione della senescenza e dei suo effetti. Questi risultati suggeriscono l’importanza della senescenza nello sviluppo della NAFLD/NASH e le proteine BMP4/Gremlin 1come possibili nuovi bersagli terapeutici.

Commento

Lavoro ricchissimo di dati, presentati in maniera chiara, ma seguendo l’interpretazione e le scelte degli autori, più che analizzando i risultati in maniera oggettiva. Gli autori analizzano l’espressione di 3 principali marcatori di senescenza (SA-b-Gal, p16 e p21) nelle biopsie epatiche e nel tessuto adiposo sottocutaneo e viscerale di soggetti normopeso (n=12), di pazienti con obesità e NAFLD (n=22), di cui alcuni (n=8) affetti da diabete e in terapia (n=9) e di pazienti con obesità e NASH (n=24), di cui (n=14) affetti anche da diabete e in terapia (n=18). La diagnosi di NAFLD/NASH è fatta sulla biopsia epatica (considerata il gold standard) analizzata dall’anatomo patologo sulla quale vengono quantificati mediante score specifici il grado di steatosi, di infiammazione lobulare, di fibrosi e di presenza di cellule con particolare morfologia (ballooning). Non è chiaro come sia stato possibile ottenere la biopsia epatica dal gruppo di soggetti normopeso. Inoltre i gruppi che vengono studiati raggruppano pazienti con obesità e complicanze metaboliche (T2DM) in numero differente e in presenza di terapia farmacologica diversa, di cui gli autori non tengono conto e non discutono. I parametri clinici e il diametro degli adipociti sono certamente influenzati dalla presenza di alterazioni del metabolismo glucidico, anche iniziali, come per esempio nei prediabetici, come dimostrato anche dal nostro gruppo (doi: 10.1038/s41598-019-47719-y.). Inoltre l’età media del gruppo di controllo è inferiore di circa 10 anni rispetto ai gruppi di pazienti, anche se in maniera non significativa. Nonostante queste importanti differenza tra i gruppi, l’espressione epatica di tutti e 3 i marcatori di senescenza risulta aumentata in modo significativo nei gruppi con NAFDL/NASH rispetto al controllo e nel gruppo con NASH rispetto a quello con NAFLD. I tre gruppi differiscono anche per la % di grasso epatico e di grasso viscerale quantificata mediante TAC o RMN (NASH>NAFLD>lean), ma non per quello sottocutaneo, che è molto maggiore nei gruppi NAFLD/NASH rispetto ai controlli normopeso ma non differisce statisticamente tra il gruppo NAFLD e quello NASH. Pertanto l’espressione epatica dei marcatori di senescenza correla molto bene con la quantità di grasso epatico e viscerale, ma non con quello sottocutaneo. Gli stessi marcatori di senescenza sono invece espressi in egual misura nel tessuto adiposo (sia viscerale che sottocutaneo) degli stessi pazienti con obesità, T2DM, NAFDL e NASH (manca in questo caso in gruppo di controllo nel quale probabilmente non è stata fatta la biopsia di tessuto adiposo).

Gli autori quindi concludono che vi è un aumento del processo di senescenza nella NAFLD e nella sua progressione a NASH nel fegato, ma non nel tessuto adiposo (come dimostrato da altri autori in corso di obesità) e che la senescenza è fortemente legata all’aumento del grasso viscerale. Tale dato di associazione statistica potrebbe suggerire che il tessuto adiposo viscerale espanso potrebbe rilasciare dei fattori in grado di stimolare il processo di senescenza cellulare nel fegato. Gli autori però non mostrano nessun esperimento a supporto di questa ipotesi.

Gli autori poi quantificano l’espressione di BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4) e di Gremlin 1 (proteine che avevano già studiato in lavori precedenti) nel fegato degli stessi gruppi, trovandole aumentate nei pazienti con NASH (la prima) e con NAFLD e NASH (la seconda). Trovano poi una differenza significativa anche ridividendo gli stessi pazienti in base alla presenza di T2DM, indipendentemente dalla presenza di NAFLD o NASH, complicando un po’ l’interpretazione del dato! La correlazione osservata tra l’espressione epatica dei due fattori (r=0.466 p=0.0002) li spinge a ipotizzare che GREM1 possa inibire l’effetto di BMP4. Probabilmente l’ipotesi sarà stata supportata da dati presenti in letteratura o da loro precedenti esperimenti sul ruolo e l’azione delle due proteine! In realtà la cascata del segnale di BMP non risulta modificata a livello di espressione genica nelle biopsie epatiche dei pazienti, quindi non ci sono evidenze sperimentali che indichino la via BMP4/gremlin 1 sia attivata maggiormente nei pazienti con obesità con progressione di NAFDL verso NASH.

Gli autori utilizzano allora dei modelli in vitro di epatociti (cellule umane IHH) e di sferoidi in cui coltivano insieme gli stessi epatociti umani con una linea di cellule stellate umane (cellule LX-2) per ricostruire in vitro un modello più complesso e più simile all’organo fegato. Nel primo modello viene indotta la senescenza trattando con un agente chemioterapico (doxorubicina) e viene studiato l’effetto dei due fattori BMP4 e GREM1. Nel secondo modello viene studiata la fibrosi (mediante immunofluorescenza) e l’espressione di IL-8 indotta dal trattamento con TGF-b1 e la sua modulazione da parte dei fattori BMP4 e GREM1 aggiunti esogenamente alle colture. Tutti questi esperimenti in vitro suggeriscono un effetto anti-senescenza di BMP4 e un ruolo di pro-senescenza di GREM1, quando utilizzato in una quantità almeno 10 volte superiore.

Questi dati in vitro su modelli cellulari pur interessanti e stimolanti non sembrano molto collegabili ai dati ottenuti dalle biopsie dei pazienti.

Infine gli autori utilizzano un modello di machine learning per identificare i predittori migliori della condizione di NAFLD/NASH utilizzando tutte le variabili cliniche, i dati ottenuti da TAC e RMN, i dosaggi sierici, tutte le misure di insulino-resistenza (comprese quelle ottenute dal clamp euglicemico-iperinsulinemico), i dati istologici delle biopsie epatiche (compresi gli score di fibrosi, infiammazione, steatosi e danno cellulare), il diametro medio degli adipociti e l’espressione dei vari trascritti considerati misurata nelle biopsie di fegato e di tessuto adiposo.

Da tutta questa elaborata analisi, riportata a titolo esemplificativo in Figura 7, (vedi sopra) risulta che:

• il maggiore predittore della condizione NAFLD/NASH nel suo complesso (senza considerare la presenza di complicanze metaboliche) e del grado di fibrosi nella NASH è l’espressione epatica di uno dei marcatori di senescenza (SA-b-Gal)
• il grado di steatosi e di infiammazione lobulare nella NASH viene invece predetto nella maniera migliore dalla area di grasso sia viscerale che sottocutaneo misurata con TAC e RMN (pur non essendo significativamente differente quella del sottocutaneo, come riportato sopra)
• mentre il ballooning e il contenuto di grasso nel fegato sono predetti meglio dall’area occupata dal tessuto adiposo viscerale
• da notare che nessun indice di insulino-resistenza risulta essere un buon predittore e nemmeno nessuno dei fattori circolanti considerati (trigliceridi, FFA, adiponectina, leptina, IL6). La flogosi tissutale nel fegato e nel tessuto adiposo non è stata invece misurata.

Gli autori concludono che il grado di senescenza cellulare a livello epatico sia un indicatore di rischio di danno epatico. Per avvalorare la loro ipotesi esaminano ciò che accade nei pazienti con tumore trattati con chemioterapici (noti induttori di senescenza cellulare) riportando che circa il 50% di loro sviluppa NAFLD con aumento di trigliceridi e fibrosi nel fegato (doi: 10.1155/2015/168905)